酶联免疫斑点法技术，ELISpot

是一种用于在单细胞水平上对分泌细胞因子或免疫球蛋白的细胞进行定量的灵敏分析方法。细胞分泌的细胞因子、免疫球蛋白或其他靶蛋白在分泌后立即被特异性抗体捕获，并在整个刺激过程中被持续捕获。ELISpot可以在25万个细胞中检测出一个有响应的细胞，是zui灵敏的细胞分析方法之一。该检测方法稳健且易于操作，因此既适用于大规模试验，也适用于实用研究。ELISpot已被广泛应用于研究感染性疾病、癌症、过敏和自身免疫性疾病的特异性免疫反应，以及特别热门的新冠病毒疫苗开发领域。

ELISpot实验步骤与原理示意 （示意图如下）

大致原理上分为如下7个步骤，详情已具体产品说明书为准

Step.1 包被：将单克隆捕获抗体添加到乙醇处理的PVDF膜板上

Step.2 细胞孵育：在有刺激的情况下加入细胞，孵育，细胞分泌细胞因子

Step.3 捕获分泌物：激活后的细胞，分泌的细胞因子被周围的抗体结合捕获

Step.4 检测抗体：去除细胞，清洗平板，加入生物素化的检测抗体

Step.5 链霉亲和素-酶偶联物：加入链霉亲和素偶联物，保证后续在膜上形成斑点

Step.6 加反应底物：当酶催化时，显色底物形成不溶性沉淀

Step.7 结果分析：在自动点阅读器中对结果进行分析。每个斑点对应一个分析物分泌细胞

ELISpot通常用于哪些领域呢？

ELISpot常见的领域包括：T细胞/B细胞功能研究、自身免疫检测、器官移植、疫苗和药品的研发与检测、肿瘤研究、传染病的研究和检测、病毒研究等。下面简单讲述一下T细胞，B细胞的ELISpot分析应用：

T细胞的ELISpot

ELISpot是研究特异性免疫反应的敏感方法，能够区分活化的T细胞亚群。例如，Th1细胞产生干扰素-γ、IL-2和TNF-α，而Th2细胞产生其他细胞因子，如IL-4、IL-5和IL-13。例如，这被广泛应用于传染病、癌症、过敏和自身免疫性疾病的研究。

在疫苗研究中，ELISpot是一种标准工具，用于通过测量激发强大T细胞反应的能力(通常是干扰素-γ的分泌)来确定疫苗的有效性。今天，基于ELISpot的诊断分析已经可用，包括一种通过测量T细胞对结核分枝杆菌特定抗原的反应分泌干扰素-γ来检测结核病感染患者的测试。

B细胞的ELISpot

B细胞ELISpot分析是分析抗体免疫反应的有力工具，并且是仅有的少数能直接聚焦于 抗体分泌细胞（ASC）的分析方法之一。 这种J为灵敏的方法使研究人员能够识别样 品中的ASC，并测量其总数以及那些对特定抗原分泌抗体的数量。

例如，B细胞ELISpot可以揭示血液中长期记忆B细胞的数量，这是无法用其他方法评 估的。B细胞ELISpot的主要应用包括检测B细胞对感染的反应和疫苗引发的反应。

为什么选择ELISPOT？

• 高灵敏度：20万-30万中1个阳性细胞检测率；

• 直观、可信度高：单细胞水平检测，一个阳性细胞一个斑点，斑点数量代表分泌细胞因子的细胞数量多少，斑点大小代表该细胞分泌细胞因子水平的多少；

• 高通量：一块ELISPOT板可作96test，科研工作者每天可检测数百个样品，只需少量细胞如45mL血液就足以用于测试600种不同抗原/肽类物质的反应；

• 活细胞功能检测：检测到的细胞因子不是已存在的，而是在检测过程中，被加入的刺激物刺激而分泌出来的；

• 临床实验适用：经过冻存复苏的细胞并不丧失免疫功能，对临床试验非常重要，治疗前和治疗后的样本可以进行平行测试，结果可以重复；如果试验涉及多个临床机构，血样可冻存、运输到核心实验室进行检测。

ELISPOT已成功应用领域

01感染性疾病诊断与研究

ELISPOT除了作为一种科研工具，也被用于临床诊断。近期第一个被SFDA批准的基于ELISPOT法的诊断平台(T-Spot.TB)上市。这项用于检测结核感染的测试方法，是通过测量结核特异性抗原刺激后的IFN-γ分泌情况来检测特异性的T细胞免疫反应。它可以代替传统的皮肤测试，同时大大提高了敏感性和特异性，并且不受卡介苗接种影响。ELISPOT还可用于其他感染性疾病如乙型肝炎、丙型肝炎、EB病毒、巨细胞病毒、莱姆病等的抗感染免疫研究与诊断。

02疫苗研究

ELISPOT方法是检测和评价疫苗的细胞免疫水平的国际公认的标准工具。国际上普遍采用IFN-γ ELISPOT法监测HIV疫苗研究中的免疫应答反应，在国际艾滋病疫苗行动计划中的大量监测新型HIV候选疫苗的试验中采用ELISPOT法对评价T细胞功能。ELISPOT方法是通过测量疫苗诱导较强T细胞反应的能力，来定义疫苗的效果。在疫苗研发和设计时，可应用ELISPOT方法筛选确定抗原的特异性T细胞表位；这些信息还可以被用于评估合适的免疫策略以及免疫途径。

中国药品生物制品检定所在《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》及《预防用以病毒为载体的活疫苗制剂的技术指标原则》等规定中均指出，ELISPOT方法是检测和评价疫苗细胞免疫效价的有效方法。ELISPOT技术作为检测T/B细胞特异性分泌的更敏感方法，对于检测数量较少的抗原特异性的记忆T细胞也尤为重要，已广泛用于预防性疫苗和治疗性疫苗，如艾滋病疫苗、乙肝疫苗、流感疫苗及各种肿瘤疫苗等的研制和评估。

03免疫学基础研究

根据检测的细胞因子的不同，ELISPOT可以用来区分被激活的不同的T细胞亚群。例如Th1细胞主要分泌IFN-γ，IL-2和TNF-α，而其他一些细胞因子如IL-4，IL-5和IL-13一般是由Th2细胞分泌的。在过敏研究中的一个热点就是采用ELISPOT测定Th2型细胞因子，因为Th2反应是过敏的主要反应，但通常都是低频率岀现，需要高度灵敏方法才能被成功检测到。

04过敏研究

在针对特异反应性过敏的免疫治疗中监测T细胞免疫反应；在细胞介导的接触过敏的体外检测诊断的应用中，ELISPOT方法受到越来越多过敏工作者的关注。因为对于像Th2型反应主要细胞因子IL-4这样的一贯很难通过其他方法如 flow cytometry和ELISA检测到的因子来说，应用高灵敏度的ELISPOT方法对于研究过敏原特异性免疫反应显得尤为重要。

05自身免疫病研究

ELISPOT的技术也广泛应用于自身免疫疾病的诊断及病因研究，如I型糖尿病、多发性硬化、重症肌无力、系统性红斑狼疮等疾病病因分析、疾病的预测、早期诊断、指导治疗以及预后分析等。

ELISPOT尽管主要用于T、B细胞分析，它还适用于任何想要在单细胞水平研究蛋白分泌的实验。该方法对于那些效应细胞的数量是至关重要的或者具有生物学意义的实验尤其适用，比如在LPS刺激PBMC后对分泌IL-6和IL-1β的单核细胞的量化分析；另外在分泌细胞数量特别少的研究中也尤其适用，比如浆细胞样树突状细胞，它在血液中的数量特别少，但是应用 ELISPOT能够很容易检测到其在激活后分泌的IFN-α。

例如
药物筛选：化合物和药物免疫学反应的筛选；
肿瘤免疫研究：已用于分析和评价在癌症病人中诱导肿瘤特异的T细胞的疫苗试验。治疗前后特异性细胞免疫应答水平的检测，可有效的评估治疗效果，对于治疗和用药提供重要的参考信息。
移植免疫研究：移植中排斥反应的预测。

Bioreader酶联免疫斑点分析仪型号

1、bioreader 7000E  基础款（可见光单、双色Elispot检测）

经济实惠的 Bioreader® 7000 –E 分析阅读器

全新的第 7 代使其在定位方面显着更快，更精确。

在全球合作研究中获得批准和验证：> 全球销售 300 台 Bioreader®。

可升级：现场安装其他软件包。

测量协议开发协助：包括 Spot Profiling 以自动生成优化的测量协议。

经过验证的测量程序。

前装载机，自动门。

双远心照明。

互动培训计划。

导出到 Excel/Word/Power Point。

LIMS/LIS导入和导出功能。

提供 5 - 41 MPixel 的高对比度/低噪声相机。

包括。电脑和显示器。

可选的全自动化与板“进料系统”。

可提供DQ/IQ/OQ/PQ文档。

2、bioreader 7000F 可见光多功能读板仪

获得专利的双远心照明。

带自动门的前装载机。

用于固定焦距的高清镜头的镜头更换器。

自动对焦、照明和镜头更换器由测量协议控制（GxP 锁定）。

具有 5 MPixel 的高分辨率相机（最高可用 42 MPixel）。

Excel/Word/PowerPoint 和 LIMS 导出功能。

互动内容特定的视频培训计划。

对于“幻点抑制”，更好的点分离和细胞因子定量。

可选的全自动化与板“进料系统”。

可提供DQ/IQ/OQ/PQ文档。

3、bioreader 7000F 荧光读取仪

    所有机械功能的完全自动化，包括。对焦，变焦，光圈。

    8倍滤芯更换器。

    从模型 alpha 到 gamma 和 delta 的升级选项。

    双远心照明可实现更好的细胞因子定量。

    用于 6-48 孔板和/或培养皿的自动变焦镜头。

    用于 96-384 孔板或培养皿的定焦镜头。

    荧光/UV LED 激发加上 3 种类型的白光 LED 照明。

    硬件由软件测量设置（GxP 锁定）自动控制。

    无需汞灯或氘灯，因此每小时寿命为 50 吨。

    改进了对自发荧光、簇分离、孔识别和细胞因子体积定量的抑制。

    全新的第7代使其在定位方面更快，更精确。

    单击即可导出到 PDF、Microsoft Office® 应用程序。

    前装载机，自动门。

    双远心照明。

    扬声器和互动培训计划。

    Excel/Word/Power Point 和 LIMS 导出功能。

    提供 5-41 MPixel的高对比度/低噪声相机。

    DQ/IQ/OQ/PQ文档。

第 20 代Eazyreader® - BIOREADER® 软件

    创新的 Eazyreader® 软件结合了“易用性”和多功能性和灵活性

    针对“常规扫描”等常用操作的优化应用程序

    QC 仅显示此作业所需的图标

    实时扫描、分析和叠加可以在扫描期间为每个孔同时创建多达 7 个图像

    “分析”有助于为 Elispot 初学者和专家参考创建“用户独立”测量协议

    在合作研究中得到验证

    导出选项，包括带有所有可缩放图像和结果的报告在一个文件中

    客户特定的报告模板

    视频剪辑和内容特定的帮助文件

    每个 Bioreader® 都经过合格的安装和培训

    侧面支持和互联网远程支持

    “分类”测量协议“历史”跟踪和比较工具

    用户特定的项目、设计、协议和研究防止混淆

    基于获得专利的“光度”双照明系统更准确的“细胞因子量化”

    CE EMV 证书

    21 CFR 第 11 部分模块