Mycobacterial Lipoprotein Z Triggers Efficient Innate and Adaptive Immunity for Protection Against Mycobacterium tuberculosis Infection

    分枝杆菌脂蛋白被认为在结核分枝杆菌( M.tb ) 感染期间参与毒力和免疫调节过程。在我们之前对活动性 TB 患者中 30多种 M.tb蛋白的免疫反应性的研究中，我们将分枝杆菌脂蛋白 Z (LppZ) 确定为最具免疫优势的抗原之一。LppZ 如何触发免疫反应仍不清楚。在这项研究中，我们使用鼠气囊模型和M.tb分析了 LppZ 介导的先天性和适应性免疫感染模型，分别。我们发现 LppZ 不仅可以招募炎症细胞，还可以诱导袋内促炎细胞因子的产生。LppZ 还可以在免疫后诱导强烈的 Th1 反应，并以与 BCG 疫苗接种相似的水平提供针对M.tb毒株 H37Rv 攻击的保护，但对肺的病理损伤较小。此外，我们揭示了在受攻击小鼠的肺部存在 LppZ 特异性功能性 CD4 + T 细胞，这些细胞能够分泌双重或三重细胞因子，包括 IFN-γ、IL-2 和 TNF-α。因此，我们的研究表明 LppZ 在 M.tb 期间具有很强的免疫原性感染人类和小鼠，并具有触发有效的先天和细胞免疫的能力。考虑到候选抗原在结核病疫苗开发过程中的局限性，在小鼠模型中 LppZ介导的针对 M.tb 挑战的免疫保护意味着其在疫苗开发中的潜在应用。

    由结核分枝杆菌( M.tb ) 感染引起的结核病 (TB)仍然是全球主要的传染病之一。潜伏性结核感染 (LTBI) 的高流行率是由于初次感染M.tb后不完全清除导致的，导致流行病学地区活动性结核病的高发病率 ( 1 )。因此，除了快速诊断和治疗的要求外，还迫切需要开发预防M.tb感染的疫苗和重新激活 LTBI 以控制结核病。Bacille Calmette-Guérin (BCG) 是减毒活牛分枝杆菌菌株，是目前唯一获得许可的结核病疫苗 ( 2）。虽然它在儿童时期提供了对粟粒性和脑膜结核病的保护，但它在预防青少年和成人肺结核方面的效果较差 ( 3 )。一些结核病候选疫苗已进入临床试验管道 ( 4 )。然而，用于疫苗开发的抗原在数量和效果上仍然非常有限。Ag85 家族成员研究最多，包括 Ag85A、Ag85B 和 Ag85C ( 5 , 6 )。其他分枝杆菌抗原，例如 Rv0733 ( 7 )、Rv3615c ( 8 )、HspX ( 9 ) 和 Mtb8.4 ( 10 )) 也正在研究它们作为疫苗候选抗原的潜力，但没有明显的成功。最近一项成功的 M72/AS01E（Mtb32A 和 Mtb39A）2b 期试验强调了在结核病疫苗设计中探索新抗原的动机 ( 11 )。因此，筛选和鉴定具有高免疫原性和适当免疫调节活性的新型候选抗原对于结核病疫苗的设计仍然至关重要。

    在之前的一项研究中，我们研究了 30多种 M.tb衍生蛋白用于活动性 TB 患者的细胞免疫反应 ( 7 )。其中，脂蛋白 Z (LppZ) 被确定为最具免疫优势的抗原之一 ( 7 )。LppZ 由rv3006编码，属于脂蛋白家族，在M.tb ( 12 ) 中约有 100 个成员。它在一系列分枝杆菌中普遍存在，包括麻风分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、海分枝杆菌和牛分枝杆菌，并且在M.tb的膜部分和培养上清液中均可检测到( 13 – 15）。与 Ag85A 或其他脂蛋白如 PstS-1（38 kDa 抗原）和 PstS-2 相比，LppZ 在 TB 患者中的抗体反应性最高，这些脂蛋白在培养滤液蛋白中也很丰富 ( 14 , 16 )。此外，LppZ 在空洞性和非空洞性 TB 患者中均表现出血清反应性，并具有对 TB 进行血清诊断的潜力 ( 17 )。鉴于其在活动性结核病患者中具有较强的免疫反应性，LppZ是否以及如何发挥免疫调节作用被认为值得进一步探索。

    在本研究中，在活动性 TB 患者中广泛分析了 T 细胞对 LppZ 的反应性。随后，在小鼠模型中系统地确定了 LppZ 的免疫原性和保护效力，以提供 LppZ 作为新的结核病疫苗候选抗原潜力的初步证据。

抗原特异性干扰素-γ (IFN-γ) 释放试验

根据制造商的说明，通过酶联免疫斑点 (ELISpot) 测定法检测抗原特异性 IFN-γ 释放（人 IFN-γ ELISpot 试剂盒：U-CyTech，Utrecht，Netherlands；小鼠 IFN-γ ELISpot 试剂盒：BD Biosciences） . 简而言之，96 孔 PVDF 板 (Millipore) 在 4°C 下用抗人或抗小鼠 IFN-γ 包被抗体包被过夜。新鲜分离的细胞（2.5 × 10 5在 200 μL 培养基中）与 10 μg/mL M.tb一起孵育抗原（LppZ、E6C10 融合蛋白、Ag85A）、结核菌素 PPD（Statens Serum Institut，SSI，哥本哈根，丹麦）、5 μg/mL 刀豆球蛋白 A (ConA) 或 2.5 μg/mL 植物血凝素 (PHA)（均来自 Sigma Aldrich） 20 小时，分别。通过生物素标记的检测抗体和辣根过氧化物酶 (HRP) 缀合的链霉亲和素检测 IFN-γ 分泌细胞。在室温下在黑暗中用 AEC 底物溶液显色 30 分钟。通过用软化水彻底冲洗 PVDF 膜来停止反应。将板风干并通过ELISpot Reader（BioReader Model 4000；Bio-Sys GmbH，Karben，Germany）计数斑点。抗原特异性 IFN-γ 产生细胞的数量计算为每 2.5 × 10 5 个细胞的斑点形成单位 (SFU)。

Figure 2 LppZ recruits innate cells and induces pro-inflammatory cytokine production in the murine air pouch model. After injecting CMC (vehicle), LppZ (LppZ) or Ag85A (Ag85A) recombinant protein in the pouches, mice were sacrificed at 4 h and 24 h. Cells in the pouches were collected. (A) Total cell numbers recruited in the pouches. (B) Representative graphs showing the gating strategy for analysis of infiltrating cell subsets. The absolute numbers of CD11b+ cells (C), CD11b+Ly6GhiF4/80− neutrophils (D) and CD11b+Ly6G−F4/80+ macrophages (E) were analyzed by flow cytometry. The levels of IL-1β (F), IL-6 (G), TNF-α (H), and myeloperoxidase (MPO) (I) were measured in the exudates (n = 3–6 mice per group). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.

文献地址：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30700988/